Revisión bibliográfica de la proteína fosfatasa tipo 1 (PP1) (ej 1)

1. Introducción

La regulación de los procesos celulares en respuesta a estímulos externos es fundamental y la fosforilación de proteínas es un elemento esencial en esta regulación. Tal es su importancia que en torno a un tercio de todas las proteínas eucariotas están controladas por la unión covalente de un grupo fosfato a residuos de serina, treonina o tirosina,¹ proceso catalizado por las proteínas quinasas. Esta unión covalente es reversible y la eliminación del grupo fosfato es catalizada por las fosfatasas.

   

Las células eucariotas expresan una gran variedad de proteínas quinasas y fosfatasas, cada una de ellas con su propia especificidad de sustrato, localización subcelular y regulación.¹ En células eucariotas se ha encontrado que el número quinasas es mucho superior al de fosfatasas.² Esto se debe a que cada una ha seguido una estrategia de diversificación en su evolución diferente.³ Mientras que las quinasas han aumentado en número, la diversidad estructural de las fosfatasas se genera por la unión de subunidades reguladoras al dominio catalítico de la proteína, es decir, la variabilidad surge a nivel de holoenzima.⁴ Esta unión provoca cambios en la localización subcelular de la proteína y modulan su especificidad.⁴

Todas las serina/treonina fosfatasas se dividen en tres familias:¹

• Las familias PPM y PP, en las que se encuentran enzimas dependientes de Mg²⁺.
• El resto de fosfatasas se clasifican en la familia PPP, dividida a su vez en las subfamilias PP1, PP2A, PP2B y PP5. Todas estas subfamilias contienen un núcleo estructuralmente relacionado y un mecanismo catalítico común. De tal forma que la divergencia de estas enzimas se encuentra en los extremos no catalíticos N y C terminal, a los que se pueden asociar distintas subunidades reguladoras para dar lugar a distintas holoenzimas.

Esta revisión bibliográfica se va a centrar en la proteína fosfatasa 1 (PP1), de la familia PPP.

2. Proteína fosfatasa 1 (PP1)

La proteína fosfatasa 1 (PP1) es una treonina/serina fosfatasa que está involucrada en múltiples funciones celulares, que incluyen el metabolismo del glucógeno, la contracción muscular, la progresión del ciclo celular o la actividad neuronal.⁴ Esta proteína en mamíferos tiene cuatro subunidades catalíticas distintas: PP1α, PP1β/δ, PPγ1 y PPγ2.⁵ PP1 tiene una gran efectividad catalítica, pero una especificidad intrínseca muy pequeña. Sin embargo, como se ha comentado anteriormente, presenta la característica de que es regulada por la interacción con más de 200 proteínas.⁵

2.1. Estructura

La enzima funcional PP1 consiste en dos subunidades: una catalítica y otra reguladora. La subunidad catalítica está muy conservada en todos los eucariotas tanto en secuencia como en plegamiento y centro activo.⁶ Sin embargo, existe una gran variedad de subunidades reguladoras, cuyo número aumentó considerablemente a lo largo de la evolución de los organismos multicelulares.³ Estas subunidades participan en determinar hacia qué compartimento se dirige la subunidad catalítica o su especificidad de sustrato.⁶ De esta forma, la interacción entre la subunidad catalítica y la reguladora es esencial para las funciones de PP1.

El plegamiento general de todas las isoformas de PP1 consiste en dos dominios estrechamente unidos: un dominio α/β en el extremo N-terminal y un dominio β, que también contiene un número variable de α-hélices, en el extremo C-terminal.⁷ La mayoría de las hebras β de ambos dominios convergen en una interfaz donde forman un sándwich β formado por dos láminas β.⁷ El sitio catalítico se encuentra en esta interfaz, en concreto, en una hendidura con  forma de Y, resultante de la intersección entre las denominadas hendidura ácida, hendidura hidrofóbica y hendidura C-terminal (figura 1).⁷ En este centro activo se encuentra un par de iones metálicos que forman un centro metálico binuclear esencial para que se pueda llevar a cabo la reacción catalítica.⁴

Figura 1. Representación de la superficie electrostática de PP1δ. En concreto se observa el centro activo.⁷

El centro catalítico de la enzima se encuentra muy conservado dentro de las fosfatasas de la familia PPP, de forma que siempre hay tres histidinas, dos ácidos aspárticos y una asparagina que coordinan dos iones metálicos, un átomo de Mn²⁺ y otro de Fe²⁺.⁶

Figura 2. Se muestra la coordinación conservada del centro metálico binuclear en la familia PPP. El esquema de unión al metal de PP1 se muestra a la izquierda, mientras que los residuos correspondientes a la unión al metal de otros miembros de la familia PPP se muestra a la derecha.⁶

Separando la hendidura ácida y la C-terminal se encuentra un bucle protuberante formado por los aminoácidos Asn271-Asp277 que está posicionado de forma ideal para interactuar con los inhibidores de PP1. De hecho, se considera que este bucle protuberante está directamente relacionado con la especificidad por ciertos inhibidores.⁷

Un análisis más extenso de las estructuras secundarias de la proteína se ha llevado a cabo en el ejercicio de visualización de la proteína en Rasmol.

2.2. Mecanismo catalítico

Debido a que tanto los iones metálicos que se encuentran en el centro activo, como los residuos que participan en la coordinación de estos están muy conservados, se piensa que hay un mecanismo común de reacción catalizada por metales para los miembros de la familia PPP.⁶ El mecanismo de reacción propuesto se representa en la figura 3. Los dos iones metálicos activan a una molécula de agua que inicia un ataque nucleofílico al átomo de fósforo del grupo fosfato del sustrato, provocando la separación del grupo fosfato. La His125 aporta un protón al oxígeno del sustrato defosforilado para acelerar la reacción.⁸

Figura 3. Representación esquemática del mecanismo catalítico de PP1 propuesto.⁸

2.3. Interacción entre subunidades reguladoras y catalíticas

La mayoría de las subunidades reguladoras contienen el motivo de secuencia RVxF/W (R, arginina; V, valina; x, cualquier aminoácido; F, fenilalanina; W, triptófano), que es una secuencia de unión específica a PP1. De forma que los residuos de valina y de fenilalanina del péptido se unen a aminoácidos hidrofóbicos de un bolsillo de la superficie de PP1 alejado del centro catalítico, mientras que la cadena lateral de la arginina se une por puentes de hidrógeno a PP1.⁶ De hecho, se ha demostrado que un péptido con este motivo puede desplazar eficazmente a las proteínas de unión a PP1.⁹

2.3.1. Interacción con MYPT1

¿Cómo las subunidades R mejoran la especificidad de sustrato? Para entender este proceso se va a poner como ejemplo la unión de una de estas subunidades reguladoras, MYPT1, a PP1, que le aporta una mayor afinidad por la miosina. Esta unión se produce a través de tres tipos de interacciones:⁶

• Un dominio VxF que interactúa con la superficie conservada hidrofóbica de PP1.
• Contiene un dominio de anquirina que tapa el extremo C-terminal de PP1.
• Contiene una hélice N-terminal hidrofóbica con la que se acopla a la superficie de PP1.

Figura 4. Se muestra la estructura del dominio catalítico de PP1 (azul) unido a la subunidad reguladora MYPT1 (verde). Se observan los tres elementos por los cuáles se produce la interacción: el motivo VxF, el dominio de repetición de anquirina y la hélice N-terminal hidrofóbica. Además, se muestra una visión cercana del reconocimiento del motivo VxF por PP1.⁶

Como resultado de la unión, no se producen cambios conformacionales importantes, pero sí se modifica la superficie en forma de Y del centro activo y da lugar a la aparición de una nueva superficie de reconocimiento para el sustrato.⁶ En concreto, da lugar a una hendidura catalítica extendida adaptada específicamente a la miosina y con actividad disminuida frente a otros sustratos.⁷ Además, las repeticiones de anquirina de MYPT1 aumentan aún más la especificidad por la miosina al interaccionar con ésta a través de interacciones electrostáticas.⁶ Mediante este tipo de mecanismos es como se consigue la variabilidad en la especificidad de sustrato de PP1.

Figura 5. Representaciones de la superficie electrostática de la proteína PP1 (A), de MYPT1 (B) y del complejo (C). Se observa cómo se produce la adición de la hendidura ácida de las repeticiones de anquirina a la hendidura catalítica de PP1.⁷

2.3.2. Interacción con NIPP1

Otra proteína reguladora de PP1 a destacar es el inhibidor nuclear de PP1 (NIPP1), ya que más de una tercera parte del pool nuclear de PP1 forma una holoenzima con éste.⁵ NIPP1 es un inhibidor potente de la actividad fosfatasa de PP1, pero no lo hace mediante el bloqueo del acceso al centro catalítico, sino por modificaciones en el plegamiento.⁵

La interacción de NIPP1 con PP1 se produce en tres sitios:

•  NIPP1 contiene un motivo RVxF con el que se une a la hendidura de unión a RVxF de PP1 (al igual que MYPT1), formada por los aminoácidos Phe293, Met290, Leu289, Cys291, Phe257, Arg261, Val264, Leu243, Ile169, Asp242.

Figura 6. En la imagen A se muestra la interacción de los aminoácidos valina-201 y Phe-203 de NIPP1 (azul) con el bolsillo de unión a RVxF de PP1 (gris). En la imagen B se representa una vista cercana de esta interacción.⁵

• Los residuos del extremo C-terminal de NIPP1 forman una cadena β (β1) que produce la extensión de la lámina β central de PP1 por unión a la hebra β14 de PP1 en un bolsillo hidrofóbico denominado ΦΦ formado por los residuos Leu75, Tyr78, Met282, Ile295, Leu296 y Lys297.

Figura 7. Visión ampliada de los residuos del bolsillo ΦΦ de PP1 Y el motivo ΦΦ de NIPP1.

• Determinados residuos de NIPP1 se pliegan dando lugar a una hélice α que interactúa con la superficie de PP1 formada por un gran número de aminoácidos (Arg43, Lys150, Asp154, Asn157, Asp179, Gln181, Ser182, Glu184, Arg188, Ile189, Met190, Arg191, Pro192, Thr193, Asp194, Pro196, Asp197, Gln198, Gly199).

Figura 8. En la imagen A se muestra PP1 de gris con la zona de interacción con la hélice de NIPP1 de color amarillo y NIPP1 de color azul. Mientras que en la imagen B se observa toda la superficie de PP1 que interacciona con NIPP1 de color amarillo.

En la siguiente imagen se muestra una representación de todos los sitios de interacción de NIPP1 con PP1.    

Figura 9. En la imagen A se muestra una representación del dominio de unión a PP1 de NIPP1 (azul) y la superficie de PP1α (gris), con los iones Mn²⁺ (morado) en el centro activo. En la imagen B se muestra la estructura de NIPP1 (sin PP1) con los tres sitios de interacción primarios indicados.⁵

De esta forma, estos dos bolsillos, denominados bolsillo RVxF y bolsillo ΦΦ, son esenciales para la interacción con NIPP1 (figura 10).

Figura 10. Observación del bolsillo ΦΦ de color beige y el bolsillo RVxF de color azul.  

Bibliografía

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2.        Plowman, G. D., Sudarsanam, S., Bingham, J., Whyte, D. & Hunter, T. The protein kinases of Caenorhabditis elegans: a model for signal transduction in multicellular organisms. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 13603–10 (1999).

3.        Ceulemans, H., Stalmans, W. & Bollen, M. Regulator-driven functional diversification of protein phosphatase-1 in eukaryotic evolution. Bioessays 24, 371–81 (2002).

4.        Barford, D., Das,  a K. & Egloff, M. P. The structure and mechanism of protein phosphatases: insights into catalysis and regulation. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 27, 133–164 (1998).

5.        O’Connell, N. et al. The molecular basis for substrate specificity of the nuclear NIPP1:PP1 holoenzyme. Structure 20, 1746–1756 (2012).

6.        Shi, Y. Serine/Threonine Phosphatases: Mechanism through Structure. Cell 139, 468–484 (2009).

7.        Terrak, M., Kerff, F., Langsetmo, K., Tao, T. & Dominguez, R. Structural basis of protein phosphatase 1 regulation. Nature 429, 780–4 (2004).

8.        Egloff, M. P., Cohen, P. T., Reinemer, P. & Barford, D. Crystal structure of the catalytic subunit of human protein phosphatase 1 and its complex with tungstate. J. Mol. Biol. 254, 942–59 (1995).

9.        Moorhead, G. B. et al. Displacement affinity chromatography of protein phosphatase one (PP1) complexes. BMC Biochem. 9, 28 (2008).

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