Conectividad del primer residuo de F (ej 8)

Para la realización de este ejercicio se ha utilizado un objeto tipo TProcess que permite hacer una llamada desde el programa desarrollado a Rasmol. Además, el programa es capaz de cargar la proteína de interés en Rasmol y crear y guardar una serie de comandos que permiten visualizar la los átomos que se encuentran a una distancia menor a 5 angstrom de la fenilalanina. De manera que se observa la Phe en la posición central y los átomos que la rodean en una esfera de 5 angstrom de radio. 

Tanto el archivo de la proteína como los comandos son guardados por el programa y es necesario indicar qué Rasmol se desea abrir. Solamente se ha conseguido que este programa sea capaz de abrir el Rasmol 2.7.1. que se encuentra adjunto al cuaderno de actividades. 

Se ha comprobado el correcto funcionamiento del programa y a continuación se muestran las imágenes obtenidas.

Figura 1. Las imágenes obtenidas con Rasmol tras el uso del programa desarrollado. Los átomos que se muestran han sido seleccionados por el comando creada por el programa al llamar a Rasmol.

Factores de temperatura (ej 7)

Para la realización de este ejercicio se ha implementado la función writePDB que permite la escritura de todos los campos que definen a un átomo en un PDB con la misma estructura de texto. Como resultado devuelve un texto en formato TStrings que se puede introducir en un memo para después guardarlo en un archivo que puede ser leído e interpretado por Rasmol.

En concreto, el programa desarrollado lleva a cabo la creación de un archivo donde se recogen todos los campos que caracterizan a los carbonos alfa de la proteína y permite guardarlos en un archivo. A continuación, lleva a cabo la creación de los comandos necesarios para que Rasmol represente estos carbonos alfa en modo spacefill y estén coloreados según sus factores de temperatura. El propio programa es capaz de llamar a Rasmol y producir la apertura de la proteína junto a los comandos de interés.

Los factores de temperatura, también llamados factores B, describen el desplazamiento de las posiciones atómicas respecto al valor de la media. Cuanto más flexible sea este átomo, mayor será su desplazamiento respecto a la media. Normalmente, las áreas de la proteína que tienen unos mayores valores de factor B se corresponden a regiones con una alta flexibilidad en su estructura tridimensional.[1] En la mayoría de los programas, como en Rasmol, un factor de temperatura elevado está asociado a un color rojo y un factor de temperatura bajo al color azul, mientras que los factores intermedios se encuentran en una gama entre ambos colores. 

Todas las proteínas presentan una flexibilidad inherente que les permite llevar a cabo su función gracias a la interacción con otras moléculas u proteínas.[2] Generalmente, la interacción entre una proteína y una molécula se produce por aquellas regiones en las que la flexibilidad es mayor. Sin embargo, como se va a observar en este ejercicio, esta interacción no es siempre en las zonas más flexibles de la proteína. 

Debido a que, como se ha comentado en la revisión bibliográfica, la regulación de la especificidad y localización de la proteína de estudio es llevada a cabo principalmente a través de la interacción con una serie de subunidades reguladoras, un estudio de los factores de temperatura de la proteína asignada puede ser muy interesante.

La imagen resultante al ejecutar el programa se muestra en la figura 1. La distribución de los factores de temperatura de la figura 1A muestra que la parte superior de la figura tiene un grado de flexibilidad muy bajo, mientras que la parte inferior tiene un grado de flexibilidad mayor, con tres protuberancias en los que la flexibilidad es aún mayor. Esta mayor flexibilidad podría indicar que son las zonas en las que se produce la interacción, que son zonas con menos restricciones al estar expuestas hacia el exterior o tener otra función que aún se desconoce. Para comprobar si se corresponden con zonas de interacción con otras moléculas ya descritas, se va a realizar una comparación con los residuos encontrados en la bibliografía que participan en la interacción con subunidades reguladoras.

Figura 1. Representación de la proteína en Rasmol obtenida a través del programa desarrollado. La figura B es una imagen de la visualización desde abajo de la figura A.

El extremo protuberante formado por los aminoácidos Asn271-Asp277, que ha sido asociado a la interacción con subunidades reguladoras, tiene un factor de temperatura elevado, como se muestra en la figura 2. Esto quiere decir que para que la interacción se produzca,debe haber un ajuste de la posición de los átomos de la proteína (modelo del ajuste inducido).

Figura 2. En la figura A se representan todos los carbonos alfa coloreados según su factor de temperatura, mientras que en la figura B se han destacado los carbonos alfa de Asn271-Asp277. Como se puede observar, están asociados a factores de temperatura elevados.

Sin embargo, esta asociación no se ha encontrado en el caso de la hendidura de unión al motivo RVxF, que participa en la interacción con subunidades reguladoras como NIPP1 o MYPT1. En este caso, los átomos de la hendidura no tenían un factor de temperatura elevado, como se puede observar en la figura 3. Esto podría indicar que la distribución de átomos de átomos de la hendidura de unión al motivo RVxF y el motivo RVxF se ajusta perfectamente y no es necesaria la flexibilidad de esta zona. De esta forma, se ajustaría mejor al modelo llave-cerradura. 

Figura 3. En la figura A se representan todos los carbonos alfa coloreados según su factor de temperatura, mientras que en la figura B se han destacado los carbonos alfa de la hendidura de unión al motivo RVxF. Como se puede observar, están asociados a factores de temperatura bajos.

El mismo resultado se ha encontrado en los residuos que interactúan con la hélice alfa de NIPP1. De hecho, estos residuos se encuentran en la zona más estática de la proteína, como se puede observar en la figura 4.

Figura 4. En la figura A se representan todos los carbonos alfa coloreados según su factor de temperatura, mientras que en la figura B se han destacado los carbonos alfa que interaccionan con la hélice alfa de NIPP1. Como se puede observar, están asociados a factores de temperatura bajos.

Lo mismo ocurre con los átomos del bolsillo hidrofóbico de PP1 que interactúa con los residuos del extremo C-terminal de NIPP1, los residuos asociados tienen unos factores de temperatura muy bajos, como se puede observar en la figura 5.

Figura 5. En la figura A se representan todos los carbonos alfa coloreados según su factor de temperatura, mientras que en la figura B se han destacado los carbonos alfa del bolsillo hidrófobico de PP1 que interaccionan con el extremo C-terminal de NIPP1. Como se puede observar, están asociados a factores de temperatura bajos.

Bibliografía

[1] The Protein Databank (PDB): File Format and Content

http://www.proteinstructures.com/Structure/Structure/proteinstructure-databases2.html

[2]  Teilum, K., Olsen, J. G. & Kragelund, B. B. Functional aspects of protein flexibility. Cell. Mol. Life Sci. 66, 2231–47 (2009).

Visualización de PP1 en Rasmol (ej 6)

En este ejercicio se va a llevar a cabo un estudio visual de la proteína asignada, la holoenzima de la proteína fosfatasa tipo 1, mediante el uso del programa Rasmol. En concreto, se va a realizar la identificación de los principales elementos estructurales y funcionales comentados en la revisión bibliográfica.

Figura 1. Representación del plegamiento general de la proteína PP1. Se muestra una representación en ribbons y el color se ha establecido según la estructura secundaria. Además, se muestran los dos iones metálicos del centro activo de color verde.

1. Visualización de los elementos secundarios

La proteína fosfatasa tipo 1 está constituida por un total de 9 hélices alfa y 15 hebras β (figura 2).

Figura 2. Se muestra la estructura secundaria de PP1 y los iones metálicos del centro activo. En la imagen A se representan sólo las hélices α, mientras que en la imagen C sólo las láminas β. En la imagen B se muestra la estructura completa de la proteína

El plegamiento general de la proteína consiste en dos grandes dominios: un dominio α-β en el extremo N terminal formado por 6 hélices α y 4 hebras β  (figura 3-A) y un dominio predominantemente β, que contiene una estructura en barril β tipo sándwich y 4 hélices α, en el extremo C terminal (figura 3-C). Como se comentará más adelante, el centro activo se encuentra en la interfaz formada por ambos dominios.

Figura 3. Se muestran los dos dominios de PP1 con sus estructuras secundarias de distintos colores. En la imagen A se representa el dominio del extremo N-terminal, formado predominantemente por hélices α (rojo), y en la imagen C el dominio del extremo C-terminal, que contiene la estructura en barril tipo sándwich.

De todas las hebras β, 12 de ellas forman dos láminas β (constituida cada una por 6 hebras β) y éstas dan lugar a una estructura en barril beta tipo sándwich β, como se ha comentado anteriormente (figura 4).

Figura 4. En la imagen A se observa la estructura en barril, mientras que en la imagen B se observa el número de componentes de cada una de las láminas β de la proteína y la estructura en sándwich β. Aunque en la imagen no se observa, las hebras β se encuentran unidas entre sí.

Un elemento importante de la proteína es el bucle protuberante (figura 5) formado por los aminoácidos que se encuentran entre la Asn271 y el Asp277 debido a que se encuentra orientado hacia el exterior y está relacionado con la especificidad de ciertos inhibidores.

Figura 5. Se muestra el bucle protuberante formado por los aminoácidos entre Asn271 y Asp277 de color azul.

2. Centro activo

Se ha detectado un error en la denominación de los aminoácidos que forman parte del centro activo en la descripción del PDB (enlace). Los verdaderos aminoácidos que forman el centro activo, encontrados en la bibliografía¹ y corroborados con Rasmol, son D64, H66, D92, N124, H173 y H248. En el centro activo se encuentran también dos iones metálicos que también participan en el mecanismo catalítico.

Figura 6. Representación del centro catalítico de PP1. Los aminoácidos se encuentran representados según el modelo de sticks, mientras que los iones metálicos se muestran como dos esferas verdes.

Los aminoácidos N124, H248, H173, a través de un átomo de N, y D92, a través de uno de los átomos de oxígeno del grupo carboxilo de la cadena lateral, interaccionan con uno de los iones metálicos (figura 7-A). Mientras que la H66, a través de un átomo de nitrógeno, y D92 y D64, a través de átomos de oxígeno del grupo carboxilo de la cadena lateral, interaccionan con el otro ion metálico (figura 7-B).

Figura 7. Se muestra en la figura A y la figura B la interacción con el primer y segundo ion metálico, respectivamente. Se puede apreciar cómo los átomos de nitrógeno y de oxígeno que interaccionan con el ion metálico se encuentran orientados hacia el ion.

El centro activo de la proteína se encuentra en una hendidura que permite la entrada del sustrato, como se puede observar en la figura 8.

Figura 8. Se observa la hendidura en la que se encuentra el centro activo (por la presencia de los átomos de Mn²⁺)

Por otro lado, en la siguiente figura se puede intuir la hendidura en forma de Y, comentada en la revisión bibliográfica, constituida por la intersección de la hendidura C-terminal, hendidura ácida e hidrofóbica, en la que se encuentra el sitio activo.

Figura 9. Observación de la hendidura en forma de Y en la que se encuentra el centro activo, formada por la intersección entre la hendidura ácida, hidrofóbica y C-terminal.

3. Interacción con subunidades reguladoras

Como se ha comentado en la revisión bibliográfica, la unión de las subunidades reguladoras a la subunidad catalítica de PP1 se produce principalmente debido a la presencia del motivo RVxF en la subunidad reguladora que interacciona con el bolsillo de unión a RVxF de PP1. En la siguiente figura se muestra este bolsillo (parte inferior izquierda) destacado respecto al resto de la proteína. Las proteínas reguladoras, como NIPP1 o MYPT1, interaccionan siempre con este bolsillo cuando se unen a PP1.

Figura 10. Representación de la proteína PP1 y el bolsillo de unión al dominio RVxF, que se encuentra destacado en la parte inferior izquierda de la imagen por representación spacefill (izquierda) y sticks (derecha), ambas en color CPK. El resto de la proteína se ha representado según el modelo wireframe y color según estructura.

Por otro lado, otro bolsillo esencial para la unión de determinadas subunidades reguladoras, en concreto para la unión de NIPP1, es el bolsillo hidrofóbico denominado ΦΦ. En la siguiente imagen se muestra este bolsillo (parte inferior izquierda) destacado respecto al resto de la proteína.

Figura 11. Representación de la proteína PP1 y el bolsillo hidrofóbico ΦΦ, que se encuentra destacado en la parte inferior izquierda de la imagen por representación spacefill (derecha) y sticks (izquierda), ambas en color CPK. El resto de la proteína se ha representado según el modelo wireframe y color según estructura.

Además, para la interacción con NIPP1 se ha observado que en PP1 hay una superficie esencial formada por un gran número de aminoácidos, destacada en la siguiente figura, que interacciona con la hélice α de NIPP1.

Figura 12. Representación de la proteína PP1 y la superficie de contacto con la que interactúa la hélice α de NIPP1, que se encuentra destacado en la parte inferior izquierda de la imagen por representación spacefill (derecha) y sticks (izquierda), ambas en color CPK. El resto de la proteína se ha representado según el modelo wireframe y color según estructura.

Todas las superficies de interacción de PP1 con las subunidades reguladoras se muestran reflejadas en la siguiente figura.

Figura 13. Representación de la proteína PP1 y la superficie de interacción con las subunidades reguladoras NIPP1 y MYPT1.